Η EcoRI θα κόψει το DNA σου παλινδρομικά, μεταξύ G και A σε κάθε αλυσίδα. Θα πάρεις λοιπόν ένα κομμάτι DNA με μονόκλωνα άκρα το οποίο και θα ενσωματώσεις σε ένα πλασμίδιο που έχει κοπεί από την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο θα μετασχηματίσει ένα βακτήριο το οποίο θ' αρχίσει να αναπαράγεται αφού το τοποθετήσεις σε καλλιέργεια και λοιπά. Ο κλώνος που θα παραχθεί θα αποτελείται από βακτήρια που φέρουν αντίγραφα του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου που εισήγαγες στο αρχικό, όπως το εισήγαγες. Θα κλωνοποιηθεί δηλαδή όλο το κομμάτι που ενσωματώθηκε στο αρχικό πλασμίδιο, στην περίπτωσή μας το όλο το ενδιάμεσο κομμάτι.
Φαντάζομαι η άσκηση δε θα σου δίνει ένα χρωμόσωμα(!!) αλλά ένα τμήμα του που στην αρχή και στο τέλος έχει την αλληλουχία που αναγνωρίζει η EcoRI. Προφανώς θα κλωνοποιηθεί το ενδιάμεσο κομμάτι, στην περίπτωση ευκαρυωτικού οργανισμού που σου ζητάει η άσκηση μάλλον. Ακόμα και να σε ρωτήσει κάτι τέτοιο δηλαδή, που δεν αλλά λέμε, λες ότι για να κλωνοποιηθεί το υπόλοιπο τμήμα του χρωμοσώματος -τα εξωτερικά κομμάτια δηλαδή- θα ήθελες άλλο φορέα κλωνοποίησης λόγω μεγέθους του DNA. Θα χρησιμοποιούσες ιό ξερωγώ, όχι πλασμίδιο.
Τέλος πάντων, κράτα ό,τι χρειάζεται στην άσκηση για τώρα. Κάτι άλλο, τα κωδικόνια έναρξης και λήξης δεν είναι ενδεικτικά του κομματιού που κλωνοποιείται. Σε ακραία άσκηση μπορούν να γίνουν χίλια δυο, με περισσότερα από ένα πιθανά τμήματα για κλωνοποίηση, περισσότερα γνωστά κωδικόνια και ούτω καθεξής. Πηγαίνεις με τη θεωρία, μόνο. Το TAG δεν είναι κάτι που ξέρεις έτσι κι αλλιώς, TAC λες.
Για το mRNA χρειάζεται η εκφώνηση, αν και πάλι μάλλον εύκολα είναι τα πράγματα. Εξαρτάται από τον οργανισμό από τον οποίο πήρες το γονίδιο. Αν είναι ευκαρυωτικός έχεις εσώνια και προκύπτει πρόδρομο mRNA το οποίο και ΔΕΝ ωριμάζει (σε βακτήριο είμαστε). Αν είναι προκαρυωτικός κανονικά χωρίς πρόβλημα.
Για τη μετάφραση δες τα δεδομένα της άσκησης. Θα λέει για υποκινητές πιθανότατα άρα, αφού βρεις το TAC (3'-5') κι ένα κωδικόνιο λήξης, θα ξέρεις τι παίζει με όλες τις διαδικασίες. Αν η EcoRI σού έχει χαλάσει τον υποκινητή θες άλλη περιοριστική για να πάρεις προϊόν (δε θα γίνει καν μεταγραφή). Αν όχι, ο υποκινητής θα βρίσκεται μετά την GAATTC ή μπορεί και να πιάνει μερικές βάσεις απ' αυτή. Από εκεί ξεκινάει η μεταγραφή και από το AUG (5'-3') στο mRNA πια η μετάφραση. Αν είμαστε σε αυτή την περίπτωση, η GAATTC ή έστω μέρος της θα ανήκει σε αμετάφραση περιοχή.
Αυτά συνοπτικά και κάπως πρόχειρα. Διάβασε τη θεωρία ξανά πριν πας να λύσεις, καλά την άσκηση και προσεκτικά ό,τι γράφεις.
Good luck.
Σημείωση: Το μήνυμα αυτό γράφτηκε 14 χρόνια πριν. Ο συντάκτης του πιθανόν να έχει αλλάξει απόψεις έκτοτε.
